Fósseis de hominídeos: DNA mitocondrial

Em julho de 1997, foi anunciada a primeira extração bem-sucedida de DNA de Neandertal. Em um artigo na revista Cell, uma equipe de pesquisadores alemães e americanos liderada por Svante Pääbo (Krings et al. 1997) alegou ter extraído DNA mitocondrial (mtDNA) de um pedaço de osso cortado do braço superior do primeiro fóssil de Neandertal reconhecido, o indivíduo encontrado na gruta de Feldhofer, no Vale de Neander, na Alemanha, em 1856 (Kahn e Gibbons 1997, Ward e Stringer 1997). Qual é a importância deste estudo?

O que é DNA mitocondrial?

O DNA (ácido desoxirribonucleico) é a molécula gigantesca utilizada para codificar a informação genética de toda a vida na Terra. As moléculas de DNA consistem em uma longa cadeia de moléculas de bases dispostas na forma de uma dupla hélice. As bases são adenina, guanina, citosina e timina, frequentemente abreviadas como A, G, C e T. O que normalmente consideramos como "nosso" DNA, porque controla a maioria dos aspectos da nossa aparência física, também é conhecido como "DNA nuclear", porque cada célula em nossos corpos contém duas cópias dele no núcleo celular.

Mitocôndrias (singular: mitocôndria) são pequenas organelas produtoras de energia encontradas nas células. Surpreendentemente, as mitocôndrias possuem suas próprias moléculas de DNA, inteiramente separadas do nosso DNA nuclear. A maioria das células contém entre 500 e 1000 cópias da molécula de mtDNA, o que torna muito mais fácil encontrá-la e extraí-la do que o DNA nuclear. No ser humano, o genoma de mtDNA consiste em cerca de 16.000 pares de bases (muito mais curto que o nosso DNA nuclear) e já foi completamente sequenciado (pelo menos para um indivíduo; Anderson et al. 1981). O que torna o mtDNA particularmente interessante é que, ao contrário do DNA nuclear, que é herdado igualmente do pai e da mãe, o mtDNA é herdado apenas da mãe, porque todas as nossas mitocôndrias descendem das presentes no óvulo da nossa mãe (no entanto, podem existir exceções raras a esta regra; veja abaixo).

Considere o conjunto de todas as mulheres vivas hoje, em seguida o conjunto de todas as suas mães, e assim por diante. Obviamente, cada conjunto será tão pequeno ou menor que o conjunto anterior. Eventualmente, o conjunto conterá apenas uma mulher, que é conhecida como "Eva mitocondrial". O DNA mitocondrial de todos os seres humanos vivos é herdado da Eva mitocondrial.

Normalmente, nosso mtDNA é idêntico ao da nossa mãe. Mas, como todo o DNA, o mtDNA sofre mutações ocasionalmente, de modo que uma das bases (A, C, G ou T) muda-se para uma base diferente. Devido a essas mutações, o mtDNA humano tem divergido lentamente do mtDNA da Eva mitocondrial, e a quantidade de mutação é aproximadamente proporcional à quantidade de tempo que se passou. Isso significa que a semelhança do mtDNA de quaisquer dois humanos fornece uma estimativa aproximada de quão estreitamente eles estão relacionados através de seus ancestrais maternos. Se eles têm mtDNA idêntico, eles estão bastante estreitamente relacionados, talvez até mesmo irmãos. Se eles têm mtDNA muito diferente, significa que seu último ancestral materno comum viveu há muito tempo.

No entanto, usar a diferença genética para estimar o tempo do último ancestral comum é difícil, por um par de razões. Uma é que a taxa na qual o mtDNA sofre mutações é mal medida. A outra é que, mesmo que a taxa média de mutação seja conhecida com precisão, algumas linhagens acumularão, por acaso, menos ou mais mutações do que a média.

Extração do DNA mitocondrial

Após a morte, o DNA começa a se degradar imediatamente. Acredita-se que, nas condições mais favoráveis, alguns fragmentos de DNA possam sobreviver por até 50.000 a 100.000 anos. O fóssil do Neandertal de Feldhofer, considerado ter entre 30.000 e 100.000 anos, estava, portanto, a testar os limites para este tipo de trabalho. No entanto, os testes iniciais do fóssil mostraram boa preservação de aminoácidos, indicando que ele pode conter mtDNA recuperável.

A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica que pode ser utilizada para criar muitas cópias de um número inicialmente pequeno de moléculas. Os pesquisadores usaram a PCR para amplificar e extrair muitos fragmentos curtos de DNA mitocondrial (mtDNA) da amostra de Neandertal. Ao sobrepor esses fragmentos, eles foram capazes de gerar uma sequência de 379 bases aparentemente proveniente do indivíduo Neandertal. Para se proteger contra erros e contaminação, cada base foi extraída em pelo menos duas amplificações separadas. A sequência foi extraída de uma seção do genoma do mtDNA conhecida como região hipervariável 1 (HVR1), assim chamada porque essa seção do genoma acumula mutações mais rapidamente que a maior parte do genoma e, portanto, é particularmente útil para distinguir entre diferentes populações.

Krings et al. em seguida compararam essa sequência contra um banco de dados de 994 sequências de mtDNA diferentes de humanos modernos. Para a sequência de mtDNA em questão, humanos diferem em média entre si em 8 +/- 3,1 posições (o '3,1' representa um desvio padrão). A maior diferença entre quaisquer dois humanos modernos foi 24, e a menor diferença foi 1 (porque duplicatas foram removidas do banco de dados).

Distribuições das Diferenças de Sequência entre Pares entre Humanos, o Neandertal e os Chimpanzés. Eixo X, o número de diferenças de sequência; Eixo Y, a porcentagem de comparações entre pares. (Krings et al, 1997)

Em contraste, o genoma dos neandertais apresentava uma média de 27 +/- 2,2 diferenças em relação aos humanos modernos (3,375 vezes a diferença média entre humanos modernos). A menor diferença entre qualquer humano e os neandertais foi de 22, e a maior diferença entre qualquer humano e os neandertais foi de 36. Essas diferenças colocam o genoma dos neandertais bem fora dos limites dos humanos modernos. Outro resultado interessante é que a sequência de DNA mitocondrial parecia igualmente distante de todos os grupos modernos de humanos. Em particular, não parecia estar mais estreitamente relacionada aos europeus, algo que poderia ter sido esperado se, como alguns cientistas pensam, os neandertais fossem pelo menos parcialmente ancestrais deles.

Em 1999, os mesmos pesquisadores conseguiram extrair com sucesso uma segunda sequência de 340 pares de bases de mtDNA do mesmo fóssil de Neandertal (Krings et al. 1999). Este estudo confirmou os resultados do primeiro. Quando as diferenças foram calculadas entre os 600 pares de bases comparáveis de 663 humanos modernos, o Neandertal e 9 chimpanzés, os humanos modernos diferiam uns dos outros por 10,9 +/- 5,1 (faixa 1-35), o Neandertal diferia dos humanos por 35,3 +/- 2,3 (faixa 29-43), e tanto os humanos quanto os dois Neandertais diferiam dos chimpanzés em cerca de 94.

mtDNA de um segundo neandertal

Em 1999, cientistas conseguiram extrair uma sequência de 345 pares de bases de mtDNA de um segundo Neandertal, um fóssil de 29.000 anos de uma criança recém-descoberto na caverna de Mesmaiskaya, no sudoeste da Rússia. (Ovchinnikov et al. 2000, Höss 2000) Os resultados deste estudo foram semelhantes aos anteriores, colocando o espécime de Mezmaiskaya fora da faixa do mtDNA humano moderno.

Além disso, os dois neandertais são bastante semelhantes, diferindo um do outro em 12 pares de bases. A diferença é maior do que a normalmente encontrada entre pares de europeus ou asiáticos modernos (apenas 1% deles diferem em 12 ou mais lugares), mas comparável às diferenças entre africanos modernos (37% deles diferem em 12 ou mais).

A distância entre Mezmaiskaya e uma sequência humana moderna particular, conhecida como sequência de referência (Anderson et al. 1981), foi de 22, comparada a 27 para o primeiro neandertal. (No entanto, não são fornecidos números para as distâncias mínima, média e máxima entre Mezmaiskaya e humanos modernos; não está claro se Mezmaiskaya está, em geral, mais próxima de humanos modernos do que Feldhofer.)

As análises filogenéticas de Ovchinnikov et al. mostram os dois neandertais agrupados juntos e separados de todos os humanos modernos. Como no primeiro espécime, Mezmaiskaya também parece estar equidistante de todos os grupos de humanos modernos, reforçando a conclusão de que os neandertais não estão estreitamente relacionados aos europeus modernos.

Como este segundo indivíduo foi descoberto a cerca de 2.500 km (1.500 milhas) do primeiro, ele fornece uma confirmação muito forte dos resultados anteriores.

O fato de que seu mtDNA também era bastante próximo ao do primeiro Neandertal torna muito menos provável que os Neandertais e os ancestrais dos humanos modernos tenham feito parte de uma população de cruzamento com uma grande quantidade de variação genética do mtDNA que foi em grande parte perdida:

"Em particular, esses dados reduzem a probabilidade de que os neandertais contivessem diversidade suficiente de sequência de mtDNA para abranger a diversidade humana moderna" (Ovchinnikov et al. 2000)

Curiosamente, a preservação do espécime de Mezmaiskaya parece ser muito melhor do que a do espécime de Feldhofer. É tão boa, na verdade, que há uma possibilidade de que todo o seu genoma de mtDNA possa ser sequenciado, e até mesmo há uma possibilidade de que parte do seu DNA nuclear possa ser recuperada.

mtDNA de um terceiro neandertal

Em 2000, cientistas anunciaram a sequenciação de um terceiro espécime de DNA mitocondrial de Neandertal de uma caverna em Vindija, Croácia (Krings et al. 2000). Quando os três Neandertais são comparados com humanos modernos, todos eles agrupam-se juntos, e à parte de todos os humanos modernos. Esta conclusão é reforçada por um estudo de Knight (2003). Knight excluiu da comparação sítios no genoma do DNA mitocondrial que são conhecidos por terem mutado mais do que uma vez, e que, portanto, são indicadores pobres de relações filogenéticas. O seu estudo confirmou fortemente estudos anteriores que mostravam histórias profundamente divergentes para as linhagens de DNA mitocondrial de humanos modernos e as conhecidas de Neandertais.

Como os humanos modernos, os neandertais apresentaram baixa diversidade genética em comparação com os grandes símios. A diversidade das três sequências de mtDNA neandertais (3,73%) é inferior à dos chimpanzés (14,82+/-5,7%) e gorilas (18,57+/-5,26%), e semelhante à dos humanos modernos em todo o mundo (3,43+/-1,22%). Se os humanos modernos forem divididos em grupos continentais, a diversidade dos três neandertais é semelhante (dentro de um desvio padrão de) a dos africanos, asiáticos, nativos americanos e aborígenes australianos, e oceanianos. Os europeus modernos, que vivem em aproximadamente a mesma região que os neandertais, têm menos diversidade do que os neandertais.

Ainda mais mtDNA neandertal

Serre et al. (2004) conseguiram sequenciar o mtDNA de quatro outros fósseis de Neandertal, juntamente com o mtDNA de cinco humanos modernos antigos. Os quatro Neandertais possuíam mtDNA semelhante ao encontrado nos Neandertais anteriores. Serre e seus colegas não encontraram evidências de fluxo gênico de mtDNA entre humanos modernos e Neandertais em nenhuma direção, mas não puderam descartar a possibilidade de um fluxo gênico limitado. Curiosamente, as sequências de mtDNA dos Neandertais de Vindija, que apresentam uma anatomia de Neandertal menos extrema do que a dos Neandertais clássicos e são considerados por alguns cientistas como transicionais entre humanos modernos e Neandertais clássicos, não estavam mais próximos dos humanos modernos do que o resto dos fósseis de Neandertal.

Até 2008, 17 sequências de mtDNA foram extraídas de fósseis de Neandertal (Green et al. 2008). Todas essas sequências apoiam a conclusão de que o mtDNA de Neandertal está fora do intervalo do mtDNA humano moderno e indicam fortemente que os Neandertais não fizeram nenhuma contribuição duradoura para o pool gênico do mtDNA humano. (No entanto, isso não prova que eles não fizeram contribuições para o DNA nuclear de nenhum humano moderno.)

O primeiro genoma completo de mtDNA de Neandertal

Green: comparações humano/humano; Vermelho: comparações humano/N'tal; Azul: comparações humano/ chimpanzé. Eixo X, o número de diferenças na sequência; Eixo Y, a fração de comparações em pares. (Green et al. 2008)

Entre os humanos, as sequências apresentavam entre 2 e 118 diferenças. O número de diferenças entre as mtDNAs humanas e a mtDNA neandertal varia de 201 a 234. A sobreposição minúscula entre os valores humanos e os neandertais no gráfico original desapareceu e, em vez disso, agora há uma lacuna considerável entre os resultados humanos e neandertais. Green et al. concluíram que:

A análise da sequência montada estabelece inequivocamente que o DNA mitocondrial dos neandertais se situa fora da variação do DNA mitocondrial humano existente, e permite estimar a data de divergência entre as duas linhagens de DNA mitocondrial em 660.000 ± 140.000 anos.

O primeiro genoma nuclear de Neandertal

O DNA mitocondrial de Neandertal está fora do intervalo humano?

Sim.

Observe que (em referência a Krings et al. 2007) porque duas sequências humanas modernas estão a 24 bases de distância, enquanto a menor diferença entre neandertal e humano é apenas de 22, isso não significa que a sequência neandertal esteja dentro do intervalo dos humanos modernos. Para usar uma analogia, suponha que medimos a altura de 994 adultos humanos, e eles variaram de 4'8" a 6'8" (uma diferença de 24 polegadas). Suponha que então encontramos um esqueleto com 8'6" de altura. Ninguém afirmaria que ele se enquadra no intervalo humano moderno porque está mais próximo do humano mais próximo (22 polegadas) do que o humano mais alto está do humano mais baixo (24 polegadas).

Observe também que os dois gráficos (22 e 24) medem coisas muito diferentes, tornando inválida a comparação entre os dois gráficos. Assim como o Neandertal foi comparado contra 994 humanos modernos, qualquer um desses humanos poderia ser comparado de forma semelhante aos outros 993 humanos. Podemos calcular a distância mínima, média e máxima desse humano para os outros humanos, exatamente como foi feito para o Neandertal. Se calculássemos esses valores para todos os humanos, poderíamos então calcular os valores mínimos, médios e máximos de todos os mínimos individuais, médias e máximos, e comparar esses valores contra os valores equivalentes para o Neandertal.

Não sabemos, a partir do artigo de Krings et al. 1997, a distribuição das distâncias mínimas entre humanos e outros humanos. O menor valor é 1. O maior valor, suspeito eu, pode chegar a 5. O mesmo valor para o neandertal é 22, bem fora da faixa humana.

Para distâncias médias entre humanos, sabemos que o valor médio é 8,0. A distância média mínima será um pouco menor; o valor médio máximo deve ser pelo menos 12 (isso pode ser deduzido do fato de que existem dois humanos separados por 24) e menos que 24; eu acho que seria cerca de 16 para um humano altamente atípico. Para o Neandertal, o valor é 27, novamente bem fora da faixa humana.

Para distâncias máximas, o valor máximo é 24, mas para a maioria dos humanos, a distância máxima até qualquer outro humano será menor que isso. O valor de 24 é altamente atípico, porque é obtido entre os dois indivíduos que divergiram independentemente mais longe da Eva Mitocôndrial, e é o máximo de quase meio milhão (994 * 993 / 2) comparações entre humanos modernos. Para o Neandertal, o valor é 36, novamente bem fora da faixa humana.

Em outras palavras, para todas as três medidas (distâncias mínimas, médias e máximas até outros humanos), a medida dos neandertais é muito maior que o valor máximo da mesma medida de uma amostra de 994 humanos modernos, e ainda mais distante do valor médio. O neandertal não está apenas fora do intervalo humano, mas bem fora dele.

A extração de um genoma mitocondrial completo de Neandertal (Green et al. 2008) torna a discussão acima obsoleta, pois agora sabemos que, quando o genoma completo é considerado, a sobreposição imaginária entre diferenças humano-humano e humano-Neandertal, que os criacionistas distorceram completamente, desaparece.

Problemas possíveis

A taxa de mutação do mtDNA não é bem conhecida. Um estudo de Parsons et al. (1997) encontrou uma taxa 20 vezes maior do que a calculada a partir de outras fontes. Em um artigo que revisa pesquisas sobre mtDNA, Strauss (1999a) relata que as taxas de mutação do mtDNA diferem em alguns grupos de animais e podem variar dramaticamente até mesmo em linhagens únicas. Embora existam muitos pontos de concordância, algumas datas de divergência para animais modernos calculadas a partir do mtDNA não correspondem ao que se conhece do registro fóssil. Existem sugestões de algumas fontes de que o mtDNA paterno pode, às vezes, ser herdado, o que poderia afetar análises baseadas no mtDNA.

Em 1999, Awadalla et al. publicaram um estudo sugerindo que o DNA mitocondrial (mtDNA) poderia, às vezes, ser herdado dos pais. Se o mtDNA fosse herdado apenas das mães, a correlação entre diferentes mutações não deveria depender de quão distantes estão no genoma. Em vez disso, suas medições mostraram que mutações em locais distantes no genoma do mtDNA eram menos propensas a estar correlacionadas do que mutações próximas, sugerindo que o mtDNA de mães e pais poderia, às vezes, se misturar. No entanto, até o momento, não há explicação sobre como essa recombinação poderia estar ocorrendo, e a possibilidade de que outros fenômenos estejam causando esse efeito ainda não foi refutada. Se isso ocorrer, a mistura significaria que as datas provenientes dos atuais estudos de mtDNA estariam incorretamente antigas. Se a mistura for comum o suficiente, poderia até significar que não houve uma Eva mitocondrial, porque diferentes partes da molécula de mtDNA teriam histórias diferentes. (Awadalla et al. 1999, Strauss 1999b) Outros estudos, no entanto, contradisseram esses resultados e argumentaram a favor de uma herança estritamente materna do mtDNA (Elson et al. 2001), e, de acordo com Sykes (2001), o artigo de Awadalla e outro artigo que também sugeriam que o mtDNA poderia ser herdado dos pais basearam-se em dados incorretos e foram posteriormente retirados.

Conclusões

Referências

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Green R., Malaspinas A-S, Krause J., Briggs A., et al. (2008) Uma Sequência Completa do Genoma Mitocôndrico de Neandertal Determinada por Sequenciamento de Alto Desempenho. Cell, 134:416-426.

Green et al. 2010: Uma sequência rascunho do genoma do neandertal. Science, 328:710.

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Knight A. (2003): A relação filogenética do DNA mitocondrial de Neandertal e humanos modernos baseada em sítios nucleotídicos informativos. Journal of Human Evolution, 44:627-32.

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Ovchinnikov I.V., Götherström A., Romanova G.P., Kharitonov V.M., Lidén K., e Goodwin W. (2000): Análise molecular do DNA de Neandertal do Cáucaso setentrional. Nature, 404:490-3.

Parsons T.J., Muniec D.S., Sullivan K., Woodyatt N., Alliston-Greiner R., Wilson M.R. et al. (1997): Uma alta taxa observada de substituição na região controladora do DNA mitocondrial humano. Nature Genetics, 15:363-8.

Reich, Green, Kircher et al. 2010: História genética de um grupo de hominídeos arcaicos da Caverna de Denisova na Sibéria. Nature 468:1053.

Schmitz R.W., Serre D., Bonani G., Feine S., Hillgruber F., Krainitzki H. et al. (2002): O local-tipo de Neandertal revisitado: investigações interdisciplinares de restos ósseos do Vale de Neander, Alemanha. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 99:13342-7.

Serre D., Langaney A., Chech M., Teschler-Nicola M., Paunovic M., Mennecier P. et al. (2004): Nenhuma evidência de contribuição do mtDNA de Neandertal aos primeiros humanos modernos. PLoS Biology, 2:313-7.

Strauss E. (1999a): Os relógios mitocondriais podem manter o tempo? Science, 283:1435

Strauss E. (1999b): mtDNA mostra sinais de influência paterna. Science, 286:2436

Sykes B. (2001): As sete filhas de Eva. Londres: Bantam Press. (um bom livro popular sobre DNA mitocondrial)

Ward R. e Stringer C.B. (1997): Uma pegada molecular sobre os neandertais. Nature, 388:225-6.

Comentários

Sequência mitocondrial de Neandertal armazenada no GenBank (número de acesso AF011222)

DNA Mostra que os Neandertais Não Foram Nossos Ancestrais (Universidade do Estado da Pensilvânia)

Dicas de DNA sobre neandertais: mtDNA de um terceiro neandertal

DNA dos Neandertais, por Mark Rose (Instituto Arqueológico dos Estados Unidos)

Outras referências sobre DNA mitocondrial

Concordância do DNA mitocondrial, por Kevin Miller e John Dawson

O Fogo Interior: A História em Desenvolvimento do DNA Mitocondrial Humano, de Ken Miller

Oxford Ancestors: rastreie sua linhagem de mtDNA

Esta página faz parte do FAQ sobre Fósseis de Hominídeos no Arquivo TalkOrigins.

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