Tiranossauros

@techreport{osborn1905tyrannosaurus4,
    author = "Osborn, H. F",
    title = "Tyrannosaurus e outros dinossauros carnívoros do Cretáceo",
    year = "1905",
    howpublished = "Bulletin of the American Museum of Natural History, v. 21, p. 259-265",
    note = "talkorigins_source = {true}; raw_reference = {Osborn, H. F., 1905, Tyrannosaurus e outros dinossauros carnívoros do Cretáceo: Bulletin of the American Museum of Natural History, v. 21, p. 259-265.}"
}

@techreport{osborn1906tyrannosaurus5,
    author = "Osborn, H. F",
    title = "Tyrannosaurus, Upper Cretaceous carnivorous dinosaur (second communication)",
    year = "1906",
    howpublished = "Bulletin of the American Museum of Natural History, v. 22, p. 281-296",
    note = "talkorigins\_source = {true}; raw\_reference = {Osborn, H. F., 1906, Tyrannosaurus, Upper Cretaceous carnivorous dinosaur (second communication): Bulletin of the American Museum of Natural History, v. 22, p. 281-296.}"
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@misc{osborn1912crania6,
    author = "Osborn, H. F",
    title = "Crania de Tyrannosaurus e Allosaurus",
    year = "1912",
    howpublished = "American Museum of Natural History Memoirs, v. 1, p. 1-30",
    note = "talkorigins\_source = {true}; raw\_reference = {Osborn, H. F., 1912, Crania de Tyrannosaurus e Allosaurus: American Museum of Natural History Memoirs, v. 1, p. 1-30.}"
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@article{brown1915tyrannosaurus,
    author = "Brown, Barnum",
    title = "Tyrannosaurus, um Dinossauro Carnívoro do Cretáceo",
    year = "1915",
    journal = "Scientific American",
    url = "https://doi.org/10.1038/scientificamerican10091915-322",
    doi = "10.1038/scientificamerican10091915-322",
    number = "15",
    pages = "322-323",
    volume = "113"
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@techreport{osborn1916skeletal7,
    author = "Osborn, H. F",
    title = "Adaptações esqueléticas de Ornitholestes, Struthiomimus, Tyrannosaurus",
    year = "1916",
    howpublished = "Bulletin of the American Museum of Natural History, v. 35, p. 733-771",
    note = "talkorigins\_source = {true}; raw\_reference = {Osborn, H. F., 1916, Adaptações esqueléticas de Ornitholestes, Struthiomimus, Tyrannosaurus: Bulletin of the American Museum of Natural History, v. 35, p. 733-771.}"
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@book{parks1928albertosaurus8,
    author = "Parks, W. A",
    title = "Albertosaurus arctunguis, uma nova espécie de dinossauro terópode da Formação Edmonton, Alberta",
    year = "1928",
    publisher = "University of Toronto Studies, Geological Series, v. 25, p. 1-42",
    note = "talkorigins_source = {true}; raw_reference = {Parks, W. A., 1928, Albertosaurus arctunguis, uma nova espécie de dinossauro terópode da Formação Edmonton, Alberta: University of Toronto Studies, Geological Series, v. 25, p. 1-42.}"
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@article{axelrod1968cretaceous,
    author = "Axelrod, Daniel I. e Bailey, Harry P.",
    title = "Extinção de Dinossauros do Cretáceo",
    year = "1968",
    journal = "Evolution",
    url = "https://doi.org/10.2307/2406883",
    doi = "10.2307/2406883",
    number = "3",
    pages = "595",
    volume = "22"
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@article{newman1970stance3,
    author = "Newman, B. H",
    title = "Postura e marcha no dinossauro carnívoro Tyrannosaurus",
    year = "1970",
    journal = "Biological Journal of the Linnean Society, v. 2; 119-123",
    note = "talkorigins\_source = {true}; raw\_reference = {Newman, B. H., 1970, Postura e marcha no dinossauro carnívoro Tyrannosaurus: Biological Journal of the Linnean Society, v. 2; 119-123.}"
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@misc{perle1977on9,
    author = "Perle, A",
    title = "Sobre a primeira descoberta de Alectrosaurus (Tyrannosauridae, Theropoda) do Cretáceo Inferior da Mongólia",
    year = "1977",
    howpublished = "Problemas em Geologia Mongol, v. 1977, p. 104-113; Em russo",
    note = "talkorigins_source = {true}; raw_reference = {Perle, A., 1977, Sobre a primeira descoberta de Alectrosaurus (Tyrannosauridae, Theropoda) do Cretáceo Inferior da Mongólia: Problemas em Geologia Mongol, v. 1977, p. 104-113; Em russo.}"
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@article{crossref1979first,
    title = "Primeiras Ovos de Dinossauro Carnívoro Encontrados",
    year = "1979",
    journal = "Science News",
    url = "https://doi.org/10.2307/3964110",
    doi = "10.2307/3964110",
    number = "10",
    pages = "167",
    volume = "116"
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@article{coria1995a,
    author = "Coria, Rodolfo A. e Salgado, Leonardo",
    title = "Um novo dinossauro carnívoro gigante do Cretáceo da Patagônia",
    year = "1995",
    journal = "Nature",
    url = "https://doi.org/10.1038/377224a0",
    doi = "10.1038/377224a0",
    number = "6546",
    pages = "224-226",
    volume = "377"
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@article{canale2009new,
    author = "Canale, Juan I. e Scanferla, Carlos A. e Agnolin, Federico L. e Novas, Fernando E.",
    title = "Novo dinossauro carnívoro do Cretáceo Superior do noroeste da Patagônia e a evolução dos terópodes abelisáuridos",
    year = "2009",
    journal = "Naturwissenschaften",
    url = "https://doi.org/10.1007/s00114-008-0487-4",
    doi = "10.1007/s00114-008-0487-4",
    number = "3",
    pages = "409-414",
    volume = "96"
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Após a publicação da descoberta do famoso Tyrannosaurus rex (1), um dinossauro carnívoro da Formação Hell Creek (HCF) em 1905, foi recebido com intenso interesse científico e popularidade pública, que persiste até os dias de hoje (2). Múltiplas hipóteses sobre a biologia e o comportamento do T. rex resultam de décadas de pesquisa, principalmente focada na morfologia esquelética e na biomecânica [por exemplo, (3) e referências therein]. Apenas nos últimos 15 anos, a histologia óssea foi aplicada para investigar aspectos do ciclo de vida do T. rex inacessíveis através de exames macroscópicos, abordando questões relacionadas à idade ontogenética, taxa de crescimento, maturidade esquelética e maturidade sexual. Em 2004, duas equipes avaliaram independentemente as dinâmicas de crescimento do T. rex usando osteohistologia. Seus resultados sugerem que o T. rex teve uma taxa de crescimento acelerada em comparação com outros tiranossaurídeos e atingiu o tamanho adulto em aproximadamente duas décadas (4, 5). As equipes focaram em curvas de crescimento, em vez de análises ou interpretações detalhadas das microestruturas do tecido ósseo. No entanto, a osteohistologia é crítica para estabelecer uma linha de base contra a qual a maturidade esquelética e as mudanças de crescimento na morfologia cortical relacionadas a eventos vitais neste táxon podem ser testadas. Identificar o momento da aceleração do crescimento e quantificar empiricamente as taxas de crescimento de T. rex juvenis são de especial importância porque o registro de crescimento juvenil é perdido em indivíduos mais velhos devido à remodelação e reabsorção óssea (4, 5). Aqui, examinamos a microestrutura óssea do fêmur e da tíbia de dois esqueletos de tiranossauro de status taxonômico controverso recuperados da HCF: BMRP (Museu Burpee de História Natural) 2002.4.1, um espécime em grande parte completo composto por quase todo o crânio e material postcranial substancial, e BMRP 2006.4.4, um espécime mais fragmentário. Respectivamente, estimamos que esses espécimes correspondam a 54% e 59% do comprimento corporal do FMNH (Museu Field de História Natural) PR 2081 ("Sue") (6, 7), um dos maiores T. rex conhecidos. A idade ontogenética do BMRP 2002.4.1 foi anteriormente relatada por Erickson (8) como 11 anos com base na osteohistologia da fíbula. No entanto, como a fíbula cresce mais lentamente que o fêmur e a tíbia que suportam peso, ela não reflete com precisão os aumentos anuais no tamanho corporal ou na maturidade esquelética relativa [por exemplo, (9)]. Usamos dados do fêmur e da tíbia para (i) fornecer descrições histológicas comparativas detalhadas intra- e interesqueléticas, (ii) quantificar a idade ontogenética e a maturidade esquelética relativa desses espécimes, e (iii) permitir a observação empírica da taxa de crescimento anual, com ênfase na variabilidade durante o ciclo de vida dos tiranossauros (10). Além disso, ao quantificar histologicamente a idade ontogenética do BMRP 2002.4.1 e do BMRP 2006.4.4 e inferir a maturidade esquelética, apresentamos novos dados que podem ser usados para avaliar hipóteses taxonômicas concorrentes sobre esses e outros espécimes de tiranossauro de tamanho médio descobertos na HCF, especificamente se o BMRP 2002.4.1 (e por extensão outros espécimes) representa um gênero "pigmeu" adulto de tiranossaurídeo, "Nanotyrannus." RESULTADOS Para descrições histológicas detalhadas e específicas de orientação, consulte os Materiais Suplementares. Em geral, os ossos corticais do fêmur e da tíbia do BMRP 2002.4.1 e do BMRP 2006.4.4 podem ser classificados como um complexo tecido-parallel. A vascularização e a densidade de lacunas de osteócitos são uniformemente altas em toda a extensão (Figs. 1 e 2). Nos fêmures, os osteões primários e secundários que circundam os canais vasculares são frequentemente isotrópicos na seção transversal (Fig. 1, A e B) e anisotrópicos na seção longitudinal (Fig. 1C). Também na seção transversal, o tecido primário do fêmur exibe anisotropia moderada regionalmente e anisotropia fraca localmente, correspondendo a uma arranjo solto de fibras mineralizadas em paralelo (por exemplo, Fig. 1, A e B, e fig. S3B). 1 Departamento de Anatomia e Biologia Celular, Oklahoma State University Center for Health Sciences, 1111 W.17th St., Tulsa, OK 74104, EUA. 2 Departamento de Ciências da Terra, Montana State University, P.O. Box 173480, Bozeman, MT 59717, EUA. 3 Museu das Montanhas Rochosas, Montana State University, 600 W.Kagy Blvd., Bozeman, MT 59717, EUA. 4 Paleontologia, North Carolina Museum of Natural Sciences, 11 W. Jones St., Raleigh, NC 27601, EUA. 5 Departamento de Ciências Biológicas, North Carolina State University, 3510 Thomas Hall, Campus Box 7614, Raleigh, NC 2769, EUA. 6 Chapman University, 1 University Dr., Orange, CA 92866, EUA. 7 Intellectual Ventures, 3150 139th Avenue Southeast, Bellevue, WA 98005, EUA. *Autor correspondente. Email: holly.ballard@okstate.edu, holly.n.woodward@ gmail.com Na seção transversal da tíbia do BMRP 2002.4.1 (Fig. 2A e fig. S4), os osteões primários longitudinais são isotrópicos em luz polarizada circularmente (CPL), mas as fibras dos osteões primários que circundam canais vasculares laminares, circulares e plexiformes são anisotrópicas. Em contraste, os osteões primários na tíbia do BMRP 2006.4.4 são frequentemente isotrópicos, independentemente da orientação do canal vascular. Devido à sua localização de amostragem proximal, a forma cortical da tíbia do BMRP 2006.4.4 na seção transversal difere daquela do BMRP 2002.4.1 e incorpora a crista fibular no lado lateral (figs. S2D e S8, A e F). Tecido reticular tecido-vascular altamente vascularizado está presente nas superfícies periostais anterior e anterolateral (Fig. 2C). Em ambos os indivíduos, o córtex tibial mais espesso está localizado anteriormente. De especial nota, dentro da cavidade medular do fêmur e da tíbia do BMRP 2006.4.4, o tecido primário isotrópico e vascularizado é separado do córtex por uma camada endosteal lamelar. Essas características são morfologicamente consistentes com osso medular (11); no entanto, são necessários estudos adicionais sobre a natureza sistêmica deste tecido em todo o BMRP 2006.4.4 e testes bioquímicos neste tecido para testar esta hipótese.Marcos de crescimento cíclico (CGMs), semelhantes a anéis de árvores em seção transversal fina, foram observados nos fêmures e tíbias de ambos os espécimes BMRP. Estudos sobre vertebrados extantes demonstram que os CGMs resultam de breves interrupções na osteogênese, ocorrendo com periodicidade anual e tipicamente coincidindo com o nadir (12). As pausas anuais na aposição óssea são registradas como CGMs na microestrutura cortical, seja como linhas pronunciadas de crescimento interrompido (LAGs) ou como anéis difusos de anéis. Com base na contagem de CGMs, o BMRP 2002.4.1 tinha pelo menos 13 anos de idade ao morrer (13 CGMs no fêmur e 10 CGMs na tíbia), e o BMRP 2006.4.4 tinha pelo menos 15 anos de idade ao morrer (15 CGMs no fêmur e 13 a 18 CGMs na tíbia). Tipicamente, córtices de ossos longos de vertebrados exibem CGMs amplamente espaçados dentro do córtex quando jovens, correspondendo a alta osteogênese anual. Em subadultos, os CGMs tornam-se mais próximos conforme a osteogênese diminui ao se aproximar do tamanho adulto [e.g., (10)]. Em contraste com esses padrões frequentemente observados, o espaçamento dos CGMs foi inesperadamente variável ao longo dos córtices do fêmur e da tíbia de ambos os espécimes BMRP. No fêmur do BMRP 2006.4.4, há um anel na superfície periostal no lado medial (Fig. 1D), mas, quando seguido posteriormente, o anel está dentro do córtex externo, enquanto o tecido fibrolamelar compõe o córtex da superfície periostal (Fig. 1E). Dentro do córtex mais interno no lado anterolateral, seis LAGs estão próximos (Fig. 2D). Devido à reabsorção causada pela deriva medular, essas LAGs estão ausentes dentro do córtex mais interno dos lados posterior e lateral. Prondvai et al. (13) demonstraram que interpretações imprecisas da microestrutura óssea são possíveis se o tecido mineralizado for observado em apenas um plano; especificamente, o arranjo mineral de fibras paralelas mais lentamente formado poderia ser confundido com o arranjo mineral de fibras trançadas depositado rapidamente, o que tem impacto direto nas interpretações da taxa de crescimento. Portanto, o fêmur do BMRP 2006.4.4 foi seccionado longitudinalmente em um plano anterolateral-posteromedial, e a tíbia do BMRP 2002.4.1 foi seccionada em um plano medial-lateral para avaliar com precisão a organização tecidual e as taxas de crescimento relativas associadas (Figs. 1C e 2B, e figs. S2, B e C, S5, e S7). No fêmur do BMRP 2006.4.4, os canais vasculares estão dispostos paralelamente ao plano de seção e ao eixo do osso longo. Adjacente aos canais vasculares, as fibras ósseas são altamente anisotrópicas em CPL e contêm lacunas osteocíticas com eixos longos dispostos paralelamente aos canais vasculares e ao plano de seção. O tecido das lâminas entre os osteons primários varia localmente em grau de isotropia, com forma correspondente variável nas lacunas osteocíticas. No lado medial da seção longitudinal através da tíbia do BMRP 2002.4.1, os canais vasculares estão dispostos obliquamente com numerosas comunicações (fig. S5B). Do meio até o córtex externo, os canais vasculares são mais uniformemente paralelos ao eixo ósseo, com menos canais transversais de Volkmann (fig. S5C). Adjacente aos canais vasculares, as fibras dos osteons primários são anisotrópicas em CPL com lacunas osteocíticas alongadas longitudinalmente. As fibras dentro das lâminas primárias variam localmente em isotropia e orientação da lacuna osteocítica (Fig. 2B). O córtex lateral é mais fino que o córtex medial, e os canais vasculares estão mais próximos com menos canais comunicantes (fig. S5D). DISCUSSÃO Ossos de membros exibem taxas de crescimento moderadas e carregamento de tração A comparação da organização de fibras ósseas do BMRP 2002.4.1 e BMRP 2006.4.4 em seções transversais e longitudinais usando CPL confirma que o tecido primário é geralmente mal organizado, com fibras paralelas fracas a trançadas. Lacunas osteocíticas densas e má organização de fibras ósseas, em combinação com uma rica rede vascular de osteons primários reticulares, laminares e plexiformes, são características que empiricamente correspondem a osteogênese elevada variando de 5 a 90 μm/dia (10). Não obstante, a frequência da vascularidade longitudinal, bem como feixes de fibras paralelas mal organizados prevalentemente regionais dentro das seções transversais, sugere que as taxas de crescimento anual estavam mais próximas do limite inferior (10). Os indivíduos BMRP, no entanto, experimentaram períodos ocasionais de crescimento mais rápido indicados por bandas de lâminas trançadas isotrópicas regionalmente com vascularidade reticular (e.g., Figs. 1E e 2C, e figs. S6D e S8, C e D) (10). Em ambos os espécimes BMRP, a maioria dos osteons primários, bem como alguns osteons secundários, eram isotrópicos na seção transversal. A anisotropia correspondente no exame longitudinal confirma que os feixes de fibras dentro dos osteons estão dispostos longitudinalmente (Figs. 1C e 2B, e fig. S5, B a D). Estudos sobre a resposta de ossos longos ao carregamento mostram que a orientação de fibras de colágeno longitudinal dentro de osteons secundários é comumente encontrada em regiões habitualmente carregadas por tração (14), o que também pode se aplicar à orientação de fibras de colágeno de osteons primários. Assim, futuros estudos sobre a biomecânica da locomoção de tiranossauros podem se beneficiar da incorporação de osteohistologia. Maturidade esquelética relativaEm vez de exibir um sistema fundamental externo (SFE) (Fig. 3), um complexo tecido-paralelo estende-se até a superfície periosteal em ambos os espécimes de tiranossaurídeos. Assim, a histologia apoia observações morfológicas de que BMRP 2002.4.1 e BMRP 2006.4.4 eram indivíduos esqueleticamente imaturos ao morrer (10). Em vez de fusão epifisária, que a maioria dos táxons de répteis não possui, um SFE é a única maneira de confirmar conclusivamente a obtenção do comprimento corporal adulto assintótico a partir dos ossos longos de um vertebrado. Quando presente, o SFE ocupa a superfície periosteal como LAGs (linhas de crescimento anuais) espaçadas de forma próxima (separadas por micrômetros) (Fig. 3A) ou como um anel espesso, principalmente avascular (Fig. 3B) (10). CGMs (camadas de crescimento medular) próximas à superfície periosteal podem às vezes ser confundidas com um SFE. No caso de BMRP 2006.4.4, um anel está presente na superfície periosteal tanto do fêmur (Fig. 1D) quanto da tíbia (fig. S8E), mas, quando o anel é seguido ao redor do córtex, em ambos os casos ele torna-se incorporado dentro do córtex externo e substituído por tecido primário tecido (Figs. 1E e 2C). A proximidade do anel à superfície periosteal sugere, em vez disso, que BMRP 2006.4.4 morreu logo após o crescimento retomar após o hiato anual e que a osteogênese cortical foi direcional. Idade ontogenética Com base na contagem de CGMs do fêmur, BMRP 2002.4.1 tinha >13 anos ao morrer, o que é 2 anos mais velho que a estimativa original de Erickson (8) baseada na contagem de CGMs da fíbula. O ligeiramente maior BMRP 2006.4.4 tinha >15 anos. O número de CGMs perdidas devido à expansão medular é desconhecido, impedindo uma idade exata ao morrer para BMRP 2002.4.1 e BMRP 2006.4.4. Embora o número de CGMs perdidas pudesse ser previsto com base nas espessuras zonais mais internas e um processo de retrocálculo [por exemplo, (5, 10)], o espaçamento variável entre CGMs observado em BMRP 2002.4.1 e BMRP 2006.4.4 e outros tiranossaurídeos (15) torna a técnica não confiável neste caso, e ela não foi tentada. Dentro do córtex mais interno de BMRP 2006.4.4, há uma empilhamento apertado de seis CGMs (Fig. 2D). Como as CGMs permanecem paralelas em torno do córtex e não se fundem, elas representam ou um único hiato no qual o crescimento cessou e retomou repetidamente (totalizando 13 anos de crescimento) ou até 6 anos onde ocorreu relativamente pouco crescimento anualmente (totalizando até 18 anos de crescimento) (9, 16). Este empilhamento apertado de seis CGMs não é observado no fêmur de BMRP 2006.4.4, que preserva 15 CGMs. A contagem de CGMs da tíbia parcial de BMRP 2006.4.4 é questionável porque a localização de amostragem proximal, afastada do meio do eixo, incorpora a crista fibular, introduzindo regiões associadas de remodelação e crescimento direcional que afetam as interpretações de aposição. Por causa disso e pela sua ausência no fêmur, o agrupamento observado de seis CGMs é interpretado conservadoramente como um evento de hiato único. Instâncias similares de um único hiato representado por LAGs estreitamente espaçadas são relatadas em outros tiranossauroídeos (15). Se este agrupamento de CGMs representar em vez disso 6 anos de crescimento prolongado, então BMRP 2006.4.4 demonstra o grau até o qual esses indivíduos podiam ajustar a taxa de crescimento com base na disponibilidade de recursos, neste caso prolongando a duração ontogenética de BMRP 2006.4.4 como um carnívoro de porte médio. A organização do tecido ósseo foi similar entre fêmures e tíbias, sugerindo que ambos os ossos registram aumentos anuais no tamanho corporal igualmente bem. Se as CGMs empilhadas de BMRP 2006.4.4 refletirem um único hiato, então cada fêmur preservou mais CGMs do que a tíbia associada. Estudos anteriores demonstraram que inconsistências intrasqueléticas nas contagens de CGMs são devidas a taxas variáveis de expansão da cavidade medular ou deriva cortical entre elementos (9, 17, 18) quando amostrados no meio do eixo. Portanto, nossa avaliação preliminar da histologia intrasquelética de T. rex sugere que o fêmur é mais informativo do que a tíbia, apesar de regiões de remodelação cortical de enteses tendíneas em torno do córtex. Histoanálises intrasqueléticas adicionais de espécimes de tiranossaurídeos são necessárias para testar se o fêmur é o osso de sustentação de peso preferido para avaliações simultâneas de taxas anuais de crescimento e esquelocronologia. Além da variabilidade de espessura zonal ontogenética dentro do córtex, a espessura zonal também mudou em relação à orientação cortical. Ou seja, as zonas eram frequentemente muito mais finas umas em relação às outras em um lado da seção transversal e muito mais espessas em outro lado (por exemplo, fig. S4, G e H). Este padrão é particularmente notável na tíbia de BMRP 2002.4.1 (zonas corticais mediais são as mais espessas) e no fêmur de BMRP 2006.4.4 (zonas corticais posteromediais são as mais espessas). Esta observação implica que o crescimento cortical direcional ocorreu ao longo da ontogenia e enfatiza a necessidade de seções transversais completas para análise histológica: obter um fragmento ou núcleo para estudo de uma orientação pode resultar em interpretações errôneas da taxa de crescimento e maturidade esquelética. Variabilidade no crescimento anual como resposta à abundância de recursosInterpretações da maturidade relativa em dinossauros não-avianos frequentemente dependem de tendências relatadas na espessura de zonas corticais entre CGMs da córtex interna à externa (10). A espessura da zona é tipicamente maior dentro da córtex mais interna, correspondendo ao crescimento anual rápido no início da vida. As zonas tornam-se progressivamente mais finas da córtex média à externa em indivíduos mais velhos, conforme a taxa de crescimento anual diminui, aproximando-se do comprimento corporal assintótico. Essas tendências gerais fornecem a base interpretativa para os dois estudos ontogenéticos baseados em histologia anteriores sobre o crescimento de Tyrannosaurus (4, 5). O espaçamento de CGMs dentro das córtices externas de BMRP 2002.4.1 e BMRP 2006.4.4 (Fig. 4) é mais estreito do que entre algumas CGMs mais profundas dentro das córtices, o que sugere que, embora não sejam adultos, os espécimes estavam se aproximando de um assintota de comprimento corporal em cerca de metade do comprimento corporal de FMNH PR 2081. No entanto, as espessuras zonais anuais entre CGMs mais profundas dentro das córtices de BMRP 2002.4.1 (Fig. 4A) e BMRP 2006.4.4 (Fig. 4B) são variáveis, e as zonas não progredem consistentemente de amplamente espaçadas dentro da córtex interna para mais estreitamente espaçadas na córtex externa. Devido ao espaçamento imprevisível dentro da córtex, a espessura zonal reduzida próxima à superfície periósteica é provavelmente um indicador não confiável de maturidade esquelética em BMRP 2002.4.1 e BMRP 2006.4.4. Espessuras zonais variáveis são, portanto, provavelmente observadas em indivíduos ontogeneticamente mais velhos de T. rex. Para testar essa hipótese, examinamos seções finas de fêmur e tíbia de espécimes de T. rex USNM PAL (Museu Nacional de História Natural) 555000, MOR (Museu das Montanhas Rochosas) 1125, MOR 1128, MOR 1198 e CCM (Museu do Condado de Carter) V33.1.15. Em todos os indivíduos, foi observada variabilidade nas espessuras zonais anuais. Em particular, em comparação com o espaçamento de zonas dentro da córtex média, zonas notavelmente mais finas estão presentes dentro da córtex mais interna de USNM PAL 555000 (Fig. 4C) e MOR 1128 (Fig. 4D). Esses resultados contradizem o espaçamento zonal matematicamente previsível em ossos longos de T. rex relatado por Horner e Padian (5), que utilizaram alguns dos mesmos espécimes reavaliados no presente estudo. Os resultados sugerem ainda não apenas que BMRP 2002.4.1 e BMRP 2006.4.4 ainda não haviam entrado no período de crescimento acelerado proposto para este táxon (4, 5), mas também que a precisão da curva de massa corporal generalizada de T. rex de Erickson et al. (4) seria afetada por variações individuais não detectadas no crescimento anual. Espaçamento variável de LAGs é relatado em ornitomímidos, ornitópodes [(19) e referências therein] e outros tiranossauroídeos (15) e pode correlacionar-se com a abundância anual de recursos (12, 19). Nossos dados sugerem que essa característica também caracteriza T. rex: Como o nível de organização do tecido ósseo dentro das zonas permaneceu o mesmo da córtex mais interna à superfície perióstea nos espécimes BMRP, as taxas de crescimento estiveram dentro de uma faixa similar de ano para ano. Para produzir esses extremos na aposição óssea anual, a duração do hiato de crescimento deve ter variado anualmente. Com base nos espécimes maiores de T. rex examinados aqui para comparação, o ajuste da duração do hiato de crescimento anual em resposta à abundância de recursos é uma característica fisiológica observada ao longo da ontogenia de T. rex. Independentemente da causa, o espaçamento imprevisível de CGMs observado aqui e em estudos anteriores estressa a cautela ao inferir maturidade relativa com base no espaçamento cortical de LAGs (19). A observação de CGMs estreitamente espaçadas dentro das córtices mais internas de T. rex maiores valida nossa interpretação de que o espaçamento zonal fino observado nas córtices mais externas de BMRP 2002.4.1 e BMRP 2006.4.4 não são indicadores confiáveis de maturidade relativa quando um EFS está ausente. Implicações para a hipótese de NanotyrannusAs interpretações da microestrutura óssea discutidas aqui não apenas fornecem insights sobre a ontogenia de T. rex, mas também têm implicações para discussões concernentes ao CMNH (Museu de História Natural de Cleveland) 7541 e Nanotyrannus. O CMNH 7541 consiste em um crânio isolado pequeno de 572 mm de comprimento (20). Inferido como simpátrico com T. rex, foi originalmente nomeado Gorgosaurus lancensis (21). Em 1988, Bakker et al. (22) redescreveram o CMNH 7541 como um espécime adulto de um novo gênero, Nanotyrannus. Utilizando um conjunto de dados empírico extensivo, Carr e Williamson (23) formalmente sinonimizaram Nanotyrannus em Tyrannosaurus em 2004, apoiando a interpretação do CMNH 7541 como um T. rex juvenil proposta por Rozhdestvensky em 1965 (24). Atualmente, a maioria dos especialistas em tiranossauros considera o CMNH 7541 e possíveis espécimes referidos como T. rex juvenil com base em características do crânio morfológico compartilhadas com aquelas encontradas em indivíduos juvenis não contestados de outros táxons de tiranossauros [por exemplo, (2, 20, 23, 25 – 28)]. Não obstante, várias publicações argumentaram desde então pela validade de Nanotyrannus com base não apenas nas características morfológicas do crânio tipo CMNH 7541, mas também em características do crânio um pouco maior de BMRP 2002.4.1 (770 mm de comprimento) [por exemplo, (29 – 33)], que alguns pesquisadores atribuíram a Nanotyrannus com base em características morfológicas compartilhadas que consideram autapomorfias adultas do táxon [por exemplo, (29 – 33)]. Atualmente, o BMRP 2002.4.1 é o único espécime acessado com elementos esqueléticos pós-cranianos preservados que é especificamente argumentado pelos defensores de Nanotyrannus como pertencente a esse gênero [por exemplo, (29 – 32)]. Como o CMNH 7541 carece do esqueleto pós-craniano e os defensores de Nanotyrannus referem o BMRP 2002.4.1 a esse táxon, a histologia dos ossos das pernas do BMRP 2002.4.1 (e adicionalmente do BMRP 2006.4.4; veja os Materiais Suplementares para discussão taxonômica) revela a história de vida do CMNH 7541 por meio de um proxy. Aqui, fornecemos dados histológicos que podem ser usados para rejeitar a hipótese de que Nanotyrannus foi erigido com base em um indivíduo "pigmeu" esqueleticamente maduro, resultando em duas hipóteses alternativas remanescentes: (i) Nanotyrannus é um táxon válido, mas o holótipo e todos os espécimes atualmente referidos, incluindo o BMRP 2002.4.1 e o BMRP 2006.4.4, são imaturos, sem indivíduos esqueleticamente maduros conhecidos até agora; e (ii) o CMNH 7541, o BMRP 2002.4.1, o BMRP 2006.4.4 e outros espécimes de tiranossauros de tamanho médio coletados do HCF representam estágios ontogenéticos juvenis de T. rex. Até o momento, o fêmur e a tíbia do BMRP 2002.4.1 e do BMRP 2006.4.4 são os únicos ossos de sustentação de peso de tiranossauros do HCF do Cretáceo Superior descritos histologicamente a partir de seções transversais completas, e estes universalmente demonstram características características de dinossauros juvenis em crescimento ativo que ainda não entraram em uma fase exponencial de crescimento (como demonstrado por nossos novos dados identificando zonas visivelmente mais finas dentro da córtex mais interna de espécimes de T. rex de grande porte como o USNM PAL 55500). Com base nesses dados, a última hipótese é a mais parcimoniosa e é congruente com as conclusões baseadas na morfologia de Carr (20) e Carr e Williamson (23). Incorporar espécimes adicionais de tiranossauros de tamanho médio do HCF nesta avaliação de maturidade relativa baseada em histologia é necessário para apoiar ou refutar ainda mais a hipótese parcimoniosa. Implicações paleoecológicas Sinonimização de Nanotyrannus com T. rex significa que, em vez de dois táxons de tiranossauros simpátricos dentro de assembleias faunísticas do HCF, apenas uma espécie válida de tiranossauro— T. rex —é atualmente reconhecida. Como adulto, T. rex ocupou a nicho de carnívoro de grande porte no ecossistema do HCF do Cretáceo mais recente (2, 34), alcançando uma massa corporal adulta média de ~9502 kg (6) aos 20 anos de idade (4). O BMRP 2002.4.1 e o BMRP 2006.4.4, com mais de 13 e mais de 15 anos de idade, respectivamente, eram apenas metade do comprimento de um T. rex adulto (6, 7). Hutchinson et al. (6) obtiveram uma estimativa de massa corporal média de 954 kg para o BMRP 2002.4.1, que cai dentro da faixa de massa corporal de dinossauros de tamanho médio definida por Holtz (35) como 50 a 1000 kg. Nossa confirmação histológica do BMRP 2002.4.1 e do BMRP 2006.4.4 como juvenis de tamanho médio é, portanto, congruente com uma hipótese de início atrasado do crescimento exponencial em T. rex em relação ao timing ontogenético do crescimento exponencial em outros tiranossauros (4). Como T. rex atingiu seu grande porte tardiamente na ontogenia (4), muitos aspectos de sua biologia provavelmente diferiram entre indivíduos juvenis e adultos, levando a hipóteses de que ele usou a partição de nicho ontogenética (2, 36, 37), onde o tamanho da presa é uma função do tamanho corporal (2, 36, 38). Essa estratégia de alimentação é observada hoje no arcosauriano extante Alligator, porque ele ocupa diferentes nichos de carnívoro antes e depois de alcançar a maturidade esquelética (39). Mais recentemente, Peterson e Daus (40) demonstraram que, embora capazes de perfurar ossos, o T. rex juvenil de estágio final ainda não podia esmagar ossos ou se engajar em osteofagia, e, portanto, adotou uma estratégia de alimentação distinta dos adultos. Nossa avaliação histológica do BMRP 2002.4.1 e do BMRP 2006.4.4 fornece dados críticos para entender a biologia e a ecologia do T. rex juvenil, e evidência adicional de que não havia tiranossauros simpátricos no HCF. Além disso, hipótesamos que a partição de nicho ontogenética, acoplada à capacidade de ajustar a duração da pausa anual de crescimento para rastrear a abundância de recursos, tornou o T. rex um dos terópodes não avianos mais bem-sucedidos. MATERIAIS E MÉTODOS O BMRP 2002.4.1 e o BMRP 2006.4.4 foram coletados do HCF do Condado de Carter, Montana. O espécime BMRP 2002.4.1 consiste em um crânio quase completo com pós-cránios associados, incluindo um fêmur parcial [comprimento estimado, 68,8 cm; (7)] e tíbias completas. O BMRP 2006.4.4 é muito menos completo e carece de material craniano, mas, com um comprimento de fêmur de 77,4 cm, é ligeiramente maior (e presumivelmente ontogeneticamente mais velho) que o BMRP 2002.4.1. Análise histológicaO fêmur parcial BMRP 2002.4.1 e a tíbia parcial BMRP 2006.4.4 foram processados histologicamente pelo MOR para um projeto anterior, e os resulting slides de seções finas foram disponibilizados emprestados ao autor sênior. Seções finas adicionais foram produzidas para o estudo atual para comparar diretamente características histológicas entre ossos de BMRP 2002.4.1 e BMRP 2006.4.4: Seções finas transversais completas do fêmur de BMRP 2006.4.4 e da tíbia de BMRP 2002.4.1 foram produzidas seguindo a metodologia de Padian e Lamm (10) com a permissão do BMRP e do Bureau of Land Management. Slides de seções finas da fíbula de BMRP 2002.4.1 e BMRP 2006.4.4 foram anteriormente produzidos para projetos separados. Uma idade ontogenética de 11 para BMRP 2002.4.1 foi publicada por Erickson (8) com base na histologia da fíbula, e uma idade ontogenética para BMRP 2006.4.4 não foi publicada. O acesso às seções finas da fíbula mencionadas anteriormente para histologia comparativa e esqueletocronologia neste estudo foi negado. Como resumido por Prondvai et al. (13), o osso moderno é composto por cristais de hidroxiapatita integrados e fibrilas de colágeno, com eixos longos dispostos em paralelo. Assim, a orientação de minerais inorgânicos de hidroxiapatita implica a disposição de fibras de colágeno no osso fóssil, e essa orientação pode ser inferida visualmente pela intensidade de birrefringência associada à anisotropia em luz polarizada: Se os feixes de fibras forem cortados transversalmente ao seu eixo longitudinal, eles aparecerão brilhantes (anisotrópicos), enquanto se cortados transversalmente, permanecerão escuros (isotrópicos). A orientação das fibras ósseas é tipicamente diagnosticada a partir de uma seção fina de osso cortada transversalmente ao eixo longo de uma diáfise. O tecido ósseo foi classificado como fibroso paralelo ou laminar se uniformemente anisotrópico com lacunas de osteócitos achatadas (ou seja, eixo longo da lacuna paralelo à orientação das fibras) e tecido entrelaçado se uniformemente isotrópico com lacunas arredondadas. Sem examinar o tecido ósseo nos planos longitudinal e transversal, é impossível distinguir o tecido entrelaçado, que deve permanecer isotrópico em ambas as orientações, do tecido fibroso paralelo ou laminar orientado longitudinalmente, que é isotrópico na seção transversal e, portanto, pode ser confundido com tecido entrelaçado. Essa distinção é crítica, porque faixas de taxas de aposição diária são frequentemente atribuídas com base na orientação das fibras [ver (13) para discussão]. Por essa razão, quando seções finas foram produzidas para este estudo, cada espécime foi seccionado tanto longitudinalmente quanto transversalmente para avaliar mais precisamente a orientação das fibras ósseas. Seções transversais completas das diáfises femoral e tibial de BMRP 2002.4.1 e BMRP 2006.4.4 foram removidas dos ossos usando uma serra circular com lâmina de diamante de borda contínua. As amostras removidas foram moldadas e fundidas, e as réplicas fundidas foram restauradas aos ossos fósseis. As amostras removidas foram então incorporadas em resina de poliéster Silmar, e wafers transversais foram cortados (~3 a 4 mm de espessura) para ambos os lados da linha de circunferência mínima com uma serra circular e lâmina de diamante de borda contínua. Esses wafers foram colados em lâminas de vidro fosco e polidos em uma lixadeira de velocidade variável para acabamento espelhado usando uma série de papéis de lixa de carbeto de silício de grão 60, 120, 180, 320, 600, 800 e 1200 e pastas de polimento manual de 5 e 1 μm. As espessuras finais das lâminas variaram entre 97 e 177 μm. Seções longitudinais foram feitas a partir das amostras de diáfise incorporadas, ao longo de um plano lateral-medial na tíbia de BMRP 2002.4.1 e um plano anterolateralposteromedial no fêmur de BMRP 2006.4.4, capturando as regiões mais espessas do córtex. Seções finas foram analisadas usando um microscópio polarizador Nikon Eclipse Ni-U e luz polarizada plana (ou seja, apenas o polarizador em posição), CPL, e luz cruzada polarizada com filtro lambda de 540 nm. Fotomicrografias foram tiradas usando uma câmera de microscópio Nikon Fi2. Imagens compostas de cada seção fina completa em aumento total de ×20 foram obtidas através do uso de um estágio de microscópio automatizado Applied Scientific Instrumentation e software Nikon Elements: Documentation. CGMs formados anualmente, incluindo LAGs e anéis, foram identificados e traçados digitalmente usando Adobe Photoshop CC. Comparações de espessuras zonais anuais entre CGMs foram feitas ao longo de um traçado, e medições foram tomadas no Adobe Photoshop CC. Descrições histológicas foram feitas a partir de observações usando CPL e seguem a terminologia de Padian e Lamm (10) e Prondvai et al. (13). Um CGM foi identificado como um anel se consistisse de uma banda difusa de osso fibroso paralelo e interpretado como um período de consideravelmente diminuída osteogênese. Um LAG foi identificado como um anel hipermineralizado fino, indicando um período quando a osteogênese cessou completamente.

@misc{woodward2020tyrannosaurus,
    author = "Woodward, Holly N. and Tremaine, Katie and Williams, Scott A. and Zanno, Lindsay E. and Horner, John R. and Myhrvold, Nathan",
    title = "Tyrannosaurus rex Osborn 1905",
    year = "2020",
    publisher = "Zenodo",
    abstract = "After the publication of its discovery from the famous Hell Creek Formation (HCF) in 1905, the carnivorous dinosaur Tyrannosaurus rex (1) was met with intense scientific interest and public popularity, which persists to the present day (2). Numerous hypotheses concerning T. rex biology and behavior result from decades of research primarily focused on skeletal morphology and biomechanics [e.g., (3) and references therein]. Only within the past 15 years has bone histology been applied to investigate the aspects of T. rex life history inaccessible from gross examinations, addressing questions concerning ontogenetic age, growth rate, skeletal maturity, and sexual maturity. In 2004, two teams independently assessed the growth dynamics of T. rex using osteohistology. Their results suggest that T. rex had an accelerated growth rate compared with other tyrannosaurids and achieved adult size in approximately two decades (4, 5). The teams focused on growth curves, rather than on detailed analyses or interpretations of bone tissue microstructures. However, osteohistology is critical for establishing a baseline against which skeletal maturity and growth changes in cortical morphology related to life events in this taxon can be tested. Identifying the timing of growth acceleration and empirically quantifying juvenile T. rex growth rates are of special importance because the juvenile growth record is lost in older individuals because of bone remodeling and resorption (4, 5). Here, we examine the femur and tibia bone microstructure of two tyrannosaur skeletons of controversial taxonomic status recovered from the HCF: BMRP (Burpee Museum of Natural History) 2002.4.1, a largely complete specimen composed of nearly the entire skull and substantial postcranial material, and BMRP 2006.4.4, a more fragmentary specimen. Respectively, we estimate these specimens to be 54 and 59\% the body length of FMNH (Field Museum of Natural History) PR 2081 (“Sue”) (6, 7), one of the largest known T. rex. The ontogenetic age of BMRP 2002.4.1 was previously reported by Erickson (8) as 11 years based on fibula osteohistology. However, because the fibula grows more slowly than the weight-bearing femur and tibia, it does not reflect annual increases in body size or relative skeletal maturity as accurately [e.g., (9)]. We use femur and tibia data to (i) provide detailed comparative intra- and interskeletal histological descriptions, (ii) quantify the ontogenetic age and relative skeletal maturity of these specimens, and (iii) allow empirical observation of annual growth rate, with emphasis on variability during the life history of tyrannosaurs (10). Moreover, by histologically quantifying the ontogenetic age of BMRP 2002.4.1 and BMRP 2006.4.4 and inferring skeletal maturity, we present new data that can be used to evaluate competing taxonomic hypotheses regarding these and other mid-sized tyrannosaur specimens discovered in the HCF, specifically whether BMRP 2002.4.1 (and by proxy other specimens) represents an adult “pygmy” genus of tyrannosaurid, “ Nanotyrannus.” RESULTS For detailed, orientation-specific histology descriptions, refer to the Supplementary Materials. In general, the femur and tibia cortical bones of BMRP 2002.4.1 and BMRP 2006.4.4 can be classified as a wovenparallel complex. Vascularity and osteocyte lacuna density are uniformly high throughout (Figs. 1 and 2). In the femora, the primary and secondary osteons surrounding vascular canals are frequently isotropic in the transverse section (Fig. 1, A and B) and anisotropic in the longitudinal section (Fig. 1C). Also in the transverse section, femur primary tissue exhibits moderate anisotropy regionally and weak anisotropy locally, corresponding to a loose arrangement of mineralized fibers in parallel (e.g., Fig. 1, A and B, and fig. S3B). 1 Department of Anatomy and Cell Biology, Oklahoma State University Center for Health Sciences, 1111 W.17th St., Tulsa, OK 74104, USA. 2 Department of Earth Science, Montana State University, P.O. Box 173480, Bozeman, MT 59717, USA. 3 Museum of the Rockies, Montana State University, 600 W.Kagy Blvd., Bozeman, MT 59717, USA. 4 Paleontology, North Carolina Museum of Natural Sciences, 11 W. Jones St., Raleigh, NC 27601, USA. 5 Department of Biological Sciences, North Carolina State University, 3510 Thomas Hall, Campus Box 7614, Raleigh, NC 2769, USA. 6 Chapman University, 1 University Dr., Orange, CA 92866, USA. 7 Intellectual Ventures, 3150 139th Avenue Southeast, Bellevue, WA 98005, USA. *Corresponding author. Email: holly.ballard@okstate.edu, holly.n.woodward@ gmail.com In the tibia transverse section of BMRP 2002.4.1 (Fig. 2A and fig. S4), longitudinal primary osteons are isotropic in circularly polarized light (CPL), but fibers of primary osteons encircling laminar, circular, and plexiform vascular canals are anisotropic. In contrast, primary osteons in the tibia of BMRP 2006.4.4 are frequently isotropic regardless of vascular canal orientation. Because of its proximal sampling location, the cortical shape of the tibia from BMRP 2006.4.4 in transverse section differs from that of BMRP 2002.4.1 and incorporates the fibular crest on the lateral side (figs. S2D and S8, A and F). Highly vascularized reticular woven tissue is present on the anterior and anterolateral periosteal surfaces (Fig. 2C). In both individuals, the thickest tibial cortex is located anteriorly. Of special note, within the medullary cavity of the femur and tibia of BMRP 2006.4.4, isotropic, vascularized, primary tissue is separated from the cortex by a lamellar endosteal layer. These features are morphologically consistent with medullary bone (11); however, additional studies on the systemic nature of this tissue throughout BMRP 2006.4.4 and biochemical tests on this tissue are necessary to test this hypothesis. Cyclical growth marks (CGMs), resembling tree rings in transverse thin section, were observed in the femora and tibiae of both BMRP specimens. Studies on extant vertebrates demonstrate that CGMs result from brief interruptions in osteogenesis, occurring with annual periodicity and typically coinciding with the nadir (12). The annual pauses in bone apposition are recorded as CGMs in cortical microstructure as either pronounced lines of arrested growth (LAGs) or diffuse annulus rings. On the basis of counting CGMs, BMRP 2002.4.1 was at least 13 years old at death (13 CGMs in the femur and 10 CGMs in the tibia), and BMRP 2006.4.4 was at least 15 years old at death (15 CGMs in the femur and 13 to 18 CGMs in the tibia). Typically, vertebrate long bone cortices will exhibit widely spaced CGMs within the cortex when young, corresponding to high annual osteogenesis. In subadults, CGMs become more closely spaced as osteogenesis decreases approaching adult size [e.g., (10)]. In contrast to these frequently observed patterns, the spacing of CGMs was unexpectedly variable throughout the femur and tibia cortices of both BMRP specimens. In the femur of BMRP 2006.4.4, there is an annulus at the periosteal surface on the medial side (Fig. 1D), but when followed posteriorly, the annulus is within the outer cortex, while fibrolamellar tissue makes up the cortex of the periosteal surface (Fig. 1E). Within the innermost cortex on the anterolateral side, six LAGs are closely spaced (Fig. 2D). Because of resorption from the medullary drift, these LAGs are absent within the innermost cortex of the posterior and lateral sides. Prondvai et al. (13) demonstrated that inaccurate bone microstructure interpretations are possible if the mineralized tissue is observed in only a single plane; specifically, the more slowly formed parallel-fibered mineral arrangement could be mistaken for the rapidly deposited woven-fibered mineral arrangement, which has direct bearing on growth rate interpretations. Therefore, the femur of BMRP 2006.4.4 was longitudinally sectioned in an anterolateral-posteromedial plane, and the tibia of BMRP 2002.4.1 was sectioned in a medial-lateral plane to accurately assess tissue organization and associated relative growth rates (Figs. 1C and 2B, and figs. S2, B and C, S5, and S7). In the femur of BMRP 2006.4.4, vascular canals are arranged parallel to the plane of section and to the shaft of the long bone. Adjacent to the vascular canals, bone fibers are highly anisotropic in CPL and contain osteocyte lacunae with long axes arranged parallel to the vascular canals and plane of section. Tissue of the laminae between primary osteons varies locally in degree of isotropy, with corresponding variable shape in osteocyte lacunae. On the medial side of the longitudinal section through the tibia of BMRP 2002.4.1, vascular canals are arranged obliquely with numerous communications (fig.S5B). From the mid- to the outer cortex, vascular canals are more uniformly parallel to the bone shaft, with fewer transverse Volkmann’s canals (fig. S5C). Adjacent to vascular canals, fibers of the primary osteons are anisotropic in CPL with longitudinally flattened osteocyte lacunae. Fibers within the primary laminae vary locally in isotropy and osteocyte lacuna orientation (Fig. 2B). The lateral cortex is thinner than the medial cortex, and vascular canals are more closely spaced with fewer communicating canals (fig. S5D). DISCUSSION Limb bones exhibit moderate growth rates and tension loading Comparison of BMRP 2002.4.1 and BMRP 2006.4.4 bone fiber organization in the transverse and longitudinal sections using CPL confirms that primary tissue is generally poorly organized parallel fibered to weakly woven. Dense osteocyte lacunae and poor bone fiber organization, in combination with a rich vascular network of reticular, laminar, and plexiform primary osteons, are characteristics that empirically correspond to elevated osteogenesis ranging from 5 to 90 μ m/day (10). Nonetheless, the frequency of longitudinal vascularity, as well as regionally prevalent poorly organized parallel fiber bundles within the transverse sections, suggests that annual growth rates were nearer the lower bound (10). The BMRP individuals did, however, experience occasional periods of faster growth indicated by bands of regionally isotropic woven laminae with reticular vascularity (e.g., Figs. 1E and 2C, and figs. S6D and S8, C and D) (10). In both BMRP specimens, the majority of primary osteons as well as some secondary osteons were isotropic in the transverse section. Corresponding anisotropy in longitudinal examination confirms that the fiber bundles within osteons are longitudinally arranged (Figs. 1C and 2B, and fig. S5, B to D). Studies on long bone response to loading show that longitudinal collagen fiber orientation within secondary osteons is commonly found in habitually tension-loaded regions (14), which may also apply to primary osteon collagen fiber orientation. As such, future studies on tyrannosaurid locomotion biomechanics may benefit from incorporation of osteohistology. Relative skeletal maturity Rather than exhibiting an external fundamental system (EFS) (Fig. 3), a woven-parallel complex extends to the periosteal surface in both tyrannosaurid specimens. Thus, histology supports morphological observations that BMRP 2002.4.1 and BMRP 2006.4.4 were skeletally immature individuals at death (10). In lieu of epiphyseal fusion, which most reptile taxa lack, an EFS is the only way to conclusively confirm attainment of asymptotic adult body length from the long bones of a vertebrate. When present, the EFS occupies the periosteal surface as either closely spaced LAGs (separated by micrometers) (Fig. 3A) or as a thick, primarily avascular annulus (Fig. 3B) (10). CGMs close to the periosteal surface can sometimes be mistaken for an EFS. In the case of BMRP 2006.4.4, an annulus is present at the periosteal surface of both the femur (Fig. 1D) and tibia (fig. S8E), but when the annulus is followed around the cortex, in both cases it becomes embedded within the outer cortex and superseded by woven primary tissue (Figs. 1E and 2C). The proximity of the annulus to the periosteal surface instead suggests that BMRP 2006.4.4 died soon after growth resumed following the annual hiatus and that cortical osteogenesis was directional. Ontogenetic age On the basis of femur CGM count, BMRP 2002.4.1 was>13 years old at death, which is 2 years older than the original estimate by Erickson (8) based on fibula CGM count. The slightly larger BMRP 2006.4.4 was>15 years old. The number of CGMs missing due to medullary expansion is unknown, precluding an exact age at death for BMRP 2002.4.1 and BMRP 2006.4.4. Although the number of missing CGMs could be predicted on the basis of innermost zonal thicknesses and a process of retrocalculation [e.g., (5, 10)], the variable spacing between CGMs observed in BMRP 2002.4.1 and BMRP 2006.4.4 and other tyrannosaurs (15) renders the technique unreliable in this case, and it was not attempted. Within the innermost cortex of BMRP 2006.4.4, there is a tight stacking of six CGMs (Fig. 2D). Because the CGMs remain parallel about the cortex and do not merge, they either represent a single hiatus in which growth repeatedly ceased and resumed (totaling 13 years of growth) or up to 6 years where relatively little growth occurred annually (totaling up to 18 years of growth) (9, 16). This tight stacking of six CGMs is not observed in the femur of BMRP 2006.4.4, which preserves 15 CGMs. The CGM count from the partial tibia of BMRP 2006.4.4 is questionable because the proximal sampling location away from midshaft incorporates the fibular crest, introducing associated regions of remodeling and directional growth affecting apposition interpretations. Because of this and their absence in the femur, the observed grouping of six CGMs is conservatively interpreted as a single hiatus event. Similar instances of a single hiatus represented by narrowly spaced LAGs are reported in other tyrannosauroids (15). If this grouping of CGMs instead represents 6 years of protracted growth, then BMRP 2006.4.4 demonstrates the extent to which these individuals could adjust growth rate based on resource availability, in this case prolonging the ontogenetic duration of BMRP 2006.4.4 as a mid-sized carnivore. Bone tissue organization was similar across femora and tibiae, suggesting that both bones record annual increases in body size equally well. If the stacked CGMs of BMRP 2006.4.4 reflect a single hiatus, then each femur preserved more CGMs than the associated tibia. Previous studies demonstrated that intraskeletal inconsistencies in CGM counts are due to variable rates of medullary cavity expansion or cortical drift across elements (9, 17, 18) when sampled at midshaft. Therefore, our preliminary assessment of T. rex intraskeletal histology suggests that the femur is more informative than the tibia, despite regions of cortical remodeling from tendinous entheses about the cortex. Additional intraskeletal histoanalyses of tyrannosaurid specimens are necessary to test whether the femur is the preferred weight-bearing bone for simultaneous assessments of annual growth rates and skeletochronology. In addition to ontogenetic zonal thickness variability within the cortex, zonal thickness also changed with respect to cortical orientation. That is, zones were often much thinner relative to one another on one side of the transverse section and much thicker on another side (e.g., fig. S4, G and H). This pattern is particularly noticeable in the tibia of BMRP 2002.4.1 (medial cortical zones are thickest) and the femur of BMRP 2006.4.4 (posteromedial cortical zones are thickest). This observation implies that directional cortical growth occurred over ontogeny and stresses the necessity of complete transverse sections for histological analysis: Obtaining a fragment or core for study from one orientation may result in erroneous interpretations of growth rate and skeletal maturity. Variability in annual growth as a response to resource abundance Interpretations of relative maturity in nonavian dinosaurs often rely on reported trends in the thickness of cortical zones between CGMs from the inner to the outer cortex (10). Zone thickness is typically greatest within the innermost cortex, corresponding to rapid annual growth early in life. Zones become progressively thinner in the midto the outer cortex of older individuals, as annual growth rate decreases approaching asymptotic body length. These general trends provide the interpretive foundation for the two previous histologybased ontogenetic studies on Tyrannosaurus growth (4, 5). The spacing of CGMs within the outer cortices of BMRP 2002.4.1 and BMRP 2006.4.4 (Fig. 4) is narrower than between some CGMs deeper within the cortices, which suggests that, although not adults, the specimens were approaching a body length asymptote at about one-half the body length of FMNH PR 2081. However, annual zonal thicknesses between CGMs deeper within the cortices of BMRP 2002.4.1 (Fig. 4A) and BMRP 2006.4.4 (Fig. 4B) are variable, and zones do not consistently progress from widely spaced within the inner cortex to more closely spaced in the outer cortex. Because of unpredictable spacing within the cortex, reduced zonal thickness near the periosteal surface is likely an unreliable indicator of skeletal maturity in BMRP 2002.4.1 and BMRP 2006.4.4. Variable zonal thicknesses are, thus, likely to be observed in ontogenetically older T. rex individuals. To test this hypothesis, we examined femur and tibia thin sections from T. rex specimens USNM PAL (National Museum of Natural History) 555000, MOR (Museum of the Rockies) 1125, MOR 1128, MOR 1198, and CCM (Carter County Museum) V33.1.15. In all individuals, variability in annual zonal thicknesses was observed. In particular, compared to zone spacing within the mid-cortex, noticeably thinner zones are present within the innermost cortex of USNM PAL 555000 (Fig. 4C) and MOR 1128 (Fig. 4D). These results contradict the mathematically predictable zonal spacing in T. rex long bones reported by Horner and Padian (5), which used some of the same specimens reassessed in the present study. Results further suggest not only that BMRP 2002.4.1 and BMRP 2006.4.4 had not yet entered the accelerated growth period proposed for this taxon (4, 5) but also that the accuracy of the generalized T. rex body mass curve from Erickson et al. (4) would be affected by undetected individual variation in annual growth. Variable LAG spacing is reported in ornithomimids, ornithopods [(19) and references therein], and other tyrannosauroids (15) and may correlate with annual resource abundance (12, 19). Our data suggest that this trait also characterizes T. rex: Because the level of bone tissue organization within zones remained the same from the innermost cortex to the periosteal surface in the BMRP specimens, growth rates were within a similar range from year to year. To produce these extremes in annual bone apposition, the duration of the growth hiatus must have varied annually. On the basis of the larger T. rex specimens examined here for comparison, the adjustment of annual growth hiatus duration in response to resource abundance is a physiological characteristic observed throughout T. rex ontogeny. Regardless of cause, unpredictable CGM spacing observed here and in previous studies stresses caution when inferring relative maturity based on cortical LAG spacing (19). The observation of closely spaced CGMs within the innermost cortices of larger T. rex validates our interpretation that the thin zonal spacing observed in the outermost cortices of BMRP 2002.4.1 and BMRP 2006.4.4 are not reliable indicators of relative maturity when an EFS is absent. Implications for the Nanotyrannus hypothesis The bone microstructural interpretations discussed here not only provide insight into T. rex ontogeny but also have bearing on discussions concerning CMNH (Cleveland Museum of Natural History) 7541 and Nanotyrannus. CMNH 7541 consists of a small isolated skull 572 mm in length (20). Inferred to be sympatric with T. rex, it was originally named Gorgosaurus lancensis (21). In 1988, Bakker et al. (22) redescribed CMNH 7541 as an adult specimen of a new genus, Nanotyrannus. Using an extensive empirical dataset, Carr and Williamson (23) formally synonymized Nanotyrannus into Tyrannosaurus in 2004, supporting the interpretation of CMNH 7541 as a juvenile T. rex proposed by Rozhdestvensky in 1965 (24). Presently, most tyrannosaurid specialists consider CMNH 7541 and possible referred specimens to be juvenile T. rex based on morphological skull features shared with those found in undisputed juvenile individuals of other tyrannosaurid taxa [e.g., (2, 20, 23, 25 – 28)]. Nonetheless, several publications have since argued for the validity of Nanotyrannus based not only on morphological characters of the CMNH 7541 type skull but also on characters from the somewhat larger skull of BMRP 2002.4.1 (720 mm in length) [e.g., (29 – 33)], which some researchers have assigned to Nanotyrannus based on shared morphological characters they consider adult autapomorphies of the taxon [e.g., (29 – 33)]. Currently, BMRP 2002.4.1 is the only accessioned specimen with postcranial skeletal elements preserved that is specifically argued by proponents of Nanotyrannus as belonging to that genus [e.g., (29 – 32)]. Because CMNH 7541 lacks the postcranial skeleton and proponents of Nanotyrannus refer BMRP 2002.4.1 to that taxon, the limb bone histology of BMRP 2002.4.1 (and additionally BMRP 2006.4.4; see the Supplementary Materials for taxonomic discussion) reveals the life history of CMNH 7541 by proxy. Here, we provide histological data that can be used to reject the hypothesis that Nanotyrannus was erected on the basis of a skeletally mature “pygmy” individual, resulting in two remaining alternative hypotheses: (i) Nanotyrannus is a valid taxon, but the holotype and all currently referred specimens including BMRP 2002.4.1 and BMRP 2006.4.4 are immature, with no skeletally mature individuals yet known; and (ii) CMNH 7541, BMRP 2002.4.1, BMRP 2006.4.4, and other mid-sized tyrannosaurid specimens collected from the HCF represent juvenile ontogenetic stages of T. rex. Thus far, the femur and tibia of BMRP 2002.4.1 and BMRP 2006.4.4 are the only weight-bearing bones of Upper Cretaceous HCF tyrannosaurids described histologically from complete transverse sections, and these universally demonstrate features characteristic of actively growing juvenile dinosaurs that had not yet entered an exponential phase of growth (as demonstrated by our new data identifying noticeably thinner zones within the innermost cortex of large-bodied T. rex specimens such as USNM PAL 55500). On the basis of these data, the latter hypothesis is most parsimonious and is congruent with the morphology-based conclusions of Carr (20) and Carr and Williamson (23). Incorporating additional mid-sized HCF tyrannosaurid specimens into this histology-based relative maturity assessment is necessary to further support or refute the parsimonious hypothesis. Paleoecological implications Synonymization of Nanotyrannus with T. rex means that rather than two sympatric tyrannosaurid taxa within faunal assemblages of the HCF, only one valid tyrannosaur species— T. rex —is currently recognized. As an adult, T. rex occupied the large-sized carnivore niche in the latest Cretaceous HCF ecosystem (2, 34), achieving an average adult body mass of \textasciitilde 9502 kg (6) by 20 years of age (4). BMRP 2002.4.1 and BMRP 2006.4.4, at>13 and>15 years of age, respectively, were only half the length of an adult T. rex (6, 7). Hutchinson et al. (6) obtained an averaged body mass estimate of 954 kg for BMRP 2002.4.1, which falls within the mid-sized dinosaur body mass range defined by Holtz (35) as 50 to 1000 kg. Our histological confirmation of BMRP 2002.4.1 and BMRP 2006.4.4 as mid-sized juveniles is therefore congruent with a hypothesized delayed onset of exponential growth in T. rex relative to the ontogenetic timing of exponential growth in other tyrannosaurids (4). Because T. rex attained its great size late in ontogeny (4), many aspects of its biology likely differed between juvenile and adult individuals, leading to hypotheses that it used ontogenetic niche partitioning (2, 36, 37), where prey size is a function of body size (2, 36, 38). This feeding strategy is observed today in the extant archosaur Alligator, because it occupies different carnivore niches before and after achieving skeletal maturity (39). Most recently, Peterson and Daus (40) demonstrated that although able to puncture bone, latestage juvenile T. rex could not yet crush bone or engage in osteophagy, and therefore engaged in a feeding strategy distinct from adults. Our histological assessment of BMRP 2002.4.1 and BMRP 2006.4.4 provides data critical to understanding juvenile T. rex biology and ecology, and additional evidence that there were no sympatric tyrannosaurids in the HCF. Furthermore, we hypothesize that ontogenetic niche partitioning, coupled with an ability to adjust annual growth hiatus duration to track resource abundance, made T. rex one of the most successful nonavian theropods. MATERIALS AND METHODS BMRP 2002.4.1 and BMRP 2006.4.4 were collected from the HCF of Carter County, Montana. The specimen BMRP 2002.4.1 consists of a nearly complete skull with associated postcrania, including a partial femur [estimated length, 68.8 cm; (7)] and complete tibiae. BMRP 2006.4.4 is far less complete and lacks cranial material, but with a femur length of 77.4 cm, it is slightly larger (and presumably ontogenetically older) than BMRP 2002.4.1. Histological analysis The partial femur of BMRP 2002.4.1 and the partial tibia of BMRP 2006.4.4 were histologically processed by the MOR for an earlier project, and the resulting thin section slides were made available on loan to the senior author. Additional thin sections were produced for the current study to directly compare histological features across bones of BMRP 2002.4.1 and BMRP 2006.4.4: Full transverse thin sections from the femur of BMRP 2006.4.4 and the tibia of BMRP 2002.4.1 were produced following the methodology of Padian and Lamm (10) with the permission of BMRP and the Bureau of Land Management. Fibula thin section slides of BMRP 2002.4.1 and BMRP 2006.4.4 were earlier produced for separate projects. An ontogenetic age of 11 for BMRP 2002.4.1 was published by Erickson (8) based on fibula histology, and an ontogenetic age of BMRP 2006.4.4 was not published. Access to the aforementioned fibula thin sections for comparative histology and skeletochronology in this study was denied. As summarized by Prondvai et al. (13), modern bone is composed of integrated hydroxyapatite crystals and collagen fibrils, with long axes arranged in parallel. Thus, the orientation of inorganic hydroxyapatite minerals implies collagen fiber arrangement in fossil bone, and this orientation can be inferred visually by the intensity of birefringence associated with anisotropy in polarized light: If the fiber bundles are cut across their longitudinal axis, they will appear bright (anisotropic), whereas if cut transversely, they will remain dark (isotropic). Bone fiber orientation is typically diagnosed from a thin section of bone cut transverse to the long axis of a diaphysis. Bone tissue was classified as parallel fibered or lamellar if uniformly anisotropic with flattened osteocyte lacunae (i.e., lacuna long axis parallel to fiber orientation) and woven if uniformly isotropic with rounded lacunae. Without examining bone tissue in the longitudinal as well as transverse planes, it is impossible to distinguish woven tissue, which should remain isotropic in both orientations, from longitudinally oriented parallel-fibered or lamellar tissue, which is isotropic in the transverse section and can therefore be mistaken for woven tissue. This distinction is critical, because ranges of daily apposition rates are frequently assigned on the basis of fiber orientation [see (13) for discussion]. For this reason, when thin sections were produced for this study, each specimen was sectioned both longitudinally and transversely to more accurately assess bone fiber orientation. Full transverse sections from the femoral and tibial diaphyses of BMRP 2002.4.1 and BMRP 2006.4.4 were removed from the bones using a circular saw with a continuous rim diamond blade. The samples removed were molded and cast, and the cast replicas were restored to the fossil bones. The samples removed were then embedded in Silmar polyester resin, and transverse wafers were cut (\textasciitilde 3 to 4 mm thick) to either side of the line of minimum circumference with a circular saw and continuous rim diamond blade. These wafers were glued to frosted glass slides and polished on a variable speed grinder to mirror finish using a series of 60, 120, 180, 320, 600, 800, and 1200 silicon carbide grit papers and 5- and 1-μ m hand-polish slurries. Final slide thicknesses were between 97 and 177 μ m. Longitudinal sections were made from the embedded diaphysis samples, along a lateral-medial plane in the tibia of BMRP 2002.4.1 and an anterolateralposteromedial plane in the femur of BMRP 2006.4.4, capturing the thickest regions of cortex. Thin sections were analyzed using a Nikon Eclipse Ni-U polarizing microscope and plane-polarized light (i.e., only the polarizer in position), CPL, and cross-polarized light with 540-nm lambda filter. Photomicrographs were taken using a Nikon Fi2 microscope camera. Composite images of each full thin section at ×20 total magnification were obtained through the use of an automated Applied Scientific Instrumentation microscope stage and Nikon Elements: Documentation software. Annually formed CGMs, including LAGs and annuli, were identified and digitally traced using Adobe Photoshop CC. Comparisons of annual zonal thicknesses between CGMs were made along a transect, and measurements were taken in Adobe Photoshop CC. Histological descriptions were made from observations using CPL and follow the terminology of Padian and Lamm (10) and Prondvai et al. (13). A CGM was identified as an annulus if it consisted of a diffuse band of parallel-fibered bone and interpreted as a period of considerably decreased osteogenesis. A LAG was identified as a thin hypermineralized ring, indicating a period when osteogenesis ceased altogether.",
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